4.4.1 Secuenciación del ADN

Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda, con la capacidad de transportar información.
Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN - adenina, citosina guanina, timina, que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. En el típico caso, las secuencias se presentan pegadas unas a las otras, sin espacios, como en la secuencia AAAGTCTGAC, yendo de 5' a 3' de izq. a derecha.
Una sucesión de cualquier número de nucleótidos mayor a cuatro es pasible de llamarse una secuencia. En relación a su función biológica, que puede depender del contexto, una secuencia puede tener sentido o antisentido, y ser tanto codificante o no codificante. Las secuencias de ADN pueden contener "ADN no codificante"
Las secuencias pueden derivarse de material biológico de descarte a través del proceso de secuenciación de ADN.
En algunos casos especiales, las letras seguidas de A, T, C, y G se presentan en una secuencia. Esas letras representan ambiguedad. De todas las moléculas muestreadas, hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. Las reglas de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:

A = adenina

C = citosina

G = guanina

T = timina

R = G A (purina)

Y = T C (pirimidina)

K = G T (keto)

M = A C (amino)

S = G C (enlaces fuertes)

W = A T (enlaces débiles)

B = G T C (todos y A)

D = G A T (todos y C)

H = A C T (todos y G)

V = G C A (todos y T)

N = A G C T (cualquiera

4 . 4 REPLICACION IN VITRO DEL ADN ( PCR)

es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,^[] cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

LA PCR  PRESENTA LOS SIGUIENTES PASO IMPORTANTES

1. DESNATURALIZACION se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual.

2. ALINEAMIENTO O  UNION DEL CEBADOR A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C

3. EXTENCION O ELONGACION DE LA CADENA

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3'.

EXTRACCION Y SEPARACION DEL ADN

Introducción.

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Los jabones utilizados emulsionan los lípidos de las membranas celulares y las rompen. La sal evita la unión de las proteínas al ADN.  Para aislar el ADN hay que hacer que precipite en alcohol. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interface entre el alcohol y el agua. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.

Antecedentes.

Ademas del agua, los carbohidratos, las proteinas, y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los Ácidos nucleicos (DNA y RNA) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas. Son moléculas complejas producidas por células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteinas.

Objetivo.

Extraer el ADN y ARN de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

Material.

Tubos de centrifuga 1ml.

Tubos de ensayo 5 ml.

Centrifuga.

Micropipetas de 1,000 y 200 ul.

Agua destilada estéril.

Etanol al 100% frio.

NaCl 3M.

Buffer de extracción.

Fenol/cloroformo/isopropanol frio.

Mortero y pistilo.

Papel aluminio.

Guantes.

Hígado de pollo.

Procedimiento.

A)._ rompimiento de membranas y paredes celulares.

Se tomo una muestra de hígado, posteriormente la muestra se homogenizó asta formar una textura de puré.

*El maceramiento del hígado es utilizado para el rompimiento de los tejidos y paredes celulares.

B)._ digestión.

En cuatro tubos para PCR se le coloco  1 gramo del hígado macerado. Para poder colocar la muestra asta el fondo  se tuvo que agitar con mucha fuerza el tubo. Por ultimo se agrego 500 ul del buffer de extracción en cada tubo.

* La solución buffer impide la unión del material genético con las proteínas.

C)._ separación de proteínas, carbohidratos y lípidos.

En el tercer paso se coloco a la muestra del tubo 500 ul de fenol,  con ayuda de guantes de latex y una micropipeta.

Por ultimo los cuatro tubos se colocaron en una centrifuga a 1000 rpm por un lapso de 5 min.

*la utilización de la centrifuga es para acelerar la separación de las biomoléculas.  Al fondo siempre se precipitan las moléculas de mayor densidad.

D)._ precipitación de los ácidos nucleicos.

Ya terminado los 5 minutos de centrifugación, a cada uno de los cuatro tubos se le extrae la fase más superior de la muestra y se coloca en un solo tubo para PCR.   

Ya extraída la fase acuosa se le coloco 400 ul de etanol y 75 ul de NaCl 3M. Pasado esto se agita vigorosamente en el Vortex.

Por ultimo se coloco el tubo en la ultracentrífuga a 1000 rpm en un lapso de tiempo de 2 min.  

Conclusiones.

El proceso para la separación del material genético es un método muy meticuloso, en el cual se requiere mucha asepsia y un buen  manejo de los materiales.  Por el cual requiere una serie de etapas básicas.

Cuestionario.

1._ ¿Porque el ADN en solución se precipita en presencia de un alcohol frió?

R= Por que el ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita. Ya que es insoluble en el alcohol.

2._ ¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

R= por espectrofotometría. Debidos a que  los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta.

3._ ¿Cuál es la función y la importancia del DNA en los organismos?

R= Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características específicas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteinas.

4._ Como se separamos de nuestra muestra el ADN del ARN?R= se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN y que impiden que se unan al ADN.

5._ ¿Cuál es la función del cloroformo?

R= es utilizado para extraer nonatos celulares, ósea todos los componentes celulares.

4 . 4 SECUENCIA DEL ADN

La secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular, los plásmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos aplicados, como la investigación forense. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales, plantas y microorganismos.



Secuenciación de Maxam-Gilbert

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un método para secuenciar ADN basado en la modificación química del ADN y posterior escisión en bases específicas^[8] Aunque Maxam y Gilber publicaron su secuenciación química dos años antes del trascendental artículo de Sanger y Coulson sobre su método de secuenciación "más-menos", la secuenciación de Maxam y Gilbert rápidamente se hizo más popular hasta que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada comienzo de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del método de terminación de la cadena (ver más adelante), la secuenciación de Maxam y Gilbert ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y dificultades para escalarla. Además, a diferencia del método de terminación de la cadena, los reactivos que se usan en el método de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biológico estándar.
En resumen, el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes químicos utilizados en cada caso son: DMS (G), ácido fórmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C).De ese modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer lugar de "corte" en cada molécula.
Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que varía entre un 6 y un 20%. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una autoradiografía del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia.
Conocido en ocasiones como "secuenciación química", este método se originó en el estudio de las interacciones entre ADN y proteínas (huella genética), estructura de los ácidos nucleicos y modificaciones epigenéticas del ADN, y es en estos campos donde aún tiene aplicaciones importantes.

Métodos de terminación de la cadena
El método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger necesita una hebra molde de ADN de cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucleótidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y nucleótidos modificados que terminan la elongación de la cadena de ADN. La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada reacción se añade solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucleótidos terminan la elongación de la cadena al carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN. La incorporación de un didesoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucleótidos se añaden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la secuenciación
Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante autoradiografía o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel. En la imagen de la derecha, la película de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al didesoxinucleótido que se añadió en la reacción que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.


Secuenciación alelo-específica por bisulfito

4 . 3 CONTROL GENETICO DE LA REPLICACION

El material genético de cualquier organismo (procarionte o eucarionte) está sometido a una serie de procesos cíclicos que aseguran la realización de sus dos funciones esenciales: (1 ) la transmisión entre generaciones de la información genética con fidelidad y (2) la expresión de ésa información genética con precisión para que pueda cumplir la misión para la que ha sido seleccionada. Por consiguiente, el ciclo del material genético comprende tres procesos: (1) replicación del material genético para su transmisión en copias idénticas a la descendencia, (2) transcripción del material genético que se transmite entre generaciones para sintetizar el material genético que asegura la expresión de la información en la célula y (3) traducción de la información genética de la forma de ácido nucleico a la forma de proteínas. Estos tres procesos ocurren independientemente de cuál sea la molécula transmisora principal de la información genética entre generaciones (ADN en la mayoría de los casos y ARN en el caso de los virus de ARN) y son esencialmente iguales en procariontes y en eucariontes.

.- Control de la expresión génica

La transmisión de la información genética entre generaciones y la expresión en forma de proteínas de dicha información genética no son suficientes para permitir que el programa de desarrollo de un organismo se lleve a cabo correctamente. Es necesario, además, asegurar que los genes que constituyen la información genética transmitida se expresen en momentos adecuados bien desde el punto de vista cronológico o espacial (procesos de desarrollo) o bien como respuesta a cambios en las condiciones ambientales en las que se encuentra la célula o el individuo. Por otra parte, las respuestas al ambiente o los procesos de desarrollo no suelen producirse como con secuencia de la activación de un único gen en un momento, sitio o condición determinado, sino que suele ser necesaria la expresión coordinada de un conjunto de ellos para que tenga lugar el efecto. Estos dos hechos hacen que el control de la expresión génica sea central en el proceso de la biología molecular de los seres vivos.

El modelo más coherente de regulación de la expresión génica se conoce con el nombre de Modelo del Operón que explica, como veremos, l a expresión coordinada de genes. Por otra parte, veremos a continuación cuál es el proceso por el que llega al material genético la in formación ambiental o de desarrollo que permita la expresión coordinada; estudiaremos el proceso de transducción de la señal.

4 . 2 REPLICACION DEL GENOMA EN EUCARIOTICO

Los nucleótidos trifosfatos (en la formas de ATP, GTP, CTP y TTP) se enganchan de acuerdo al modelo semi-conservativo . Otros detalles de la replicación del ADN son consistentes con los hallazgos en procariotas. El ADN eucariota tiene muchas horquillas de replicación y también síntesis bidireccional. El ADN eucariota se sintetiza mucho mas lentamente que el procariota, en humanos, a unos 50 nucleótidos por segundo y por horquilla de replicación. Luego de la replicación el nuevo ADN se asocia inmediatamente con histonas.Para una detallada descripción del proceso consultar el Curtis H.

Regulación de la expresión génica en eucariotas | Contenidos

La regulación genética de los eucariotas, especialmente en los multicelulares se complica por el proceso de diferenciación que ocurre en los organismos multicelulares. Cada organismo multicelular comienza como una sola célula llamada cigoto que se divide por mitosis. Las células se diferencian en variados tipos funcionales utilizando algunos genes e ignorando otros.
Los genes homeóticos (Homeobox genes) dirigen la organización general del cuerpo y la posición de los órganos en respuesta a un gradiente de moléculas regulatorias.
El momento("timing") en que se expresa un determinado gen parece seguir una secuencia, tal como la producción de hemoglobina fetal en los glóbulos rojos de los mamíferos, que cambia a hemoglobina adulta poco antes del nacimiento. Claramente la inactivación de ciertos genes ocurre en cada adulto y ello esta relacionado con el cancer, la prolongación de la vida y tanto otro...

Tipos de cromatina

La heterocromatina es una cromatina que se tiñe mas fuerte y es mas condensada. La eucromatina se tiñe debilmente y es mas "abierta" o sea se menos condensada. La eucromatina permanece dispersa (no condensada) durante la interfase, momento donde ocurre la transcripción del ARN.
Algunas regiones de la heterocromatina parecen ser estructurales (como la heterocromatina que se encuentra cerca de la región de los centromeros). Los cuerpos de Barr (cromosomas X irreversiblemente inactivados), son también heterocromatina condensada. Otras regiones de heterocromatina varian de célula a célula. A medida que la célula se diferencia, la proporción heterocromatina/eucromatina se incrementa, reflejando la especialización de la célula a medida que se diferencia.
Los cromosomas "plumosos" de los insectos tienen en sus "plumas" o lazos ("Loops or puffs") áreas de síntesis activa de ARN sugiriendo, nuevamente que los genes activos estan situados en la eucromatina.
Los eucariotas también tienen proteínas específicas que intervienen en los procesos de síntesis en manera similar a la de los procariotas, sin embargo, tal como cabría esperarse el proceso es mucho mas complicado.

El genoma eucariota|

El término genoma se usa para referirse a todos los alelos que posee un organismo (o una población, especie, o un gran grupo taxonómico). Si bién la cantidad de ADN de una célula diploide es constante para una especie, existen grandes diferencias entre la mismas. Homo sapiens tiene 3.5 X 109 pares de bases y la Drosophila tiene 1.5 X 108, por genoma haploide. Mucho del ADN de cada célula no tiene función o bién la misma no es conocida. Solo el 10% del ADN eucariota codifica para proteína . Los virus y procariotas aparentemente usan mucho mas sus ADN.
Practicamente la mitad del ADN eucariota corresponde a secuencia nucleotídicas repetidas. Las secuencias que codifican proteínas estan interrumpidas por regiones que no codifican. Las secuencias no codificantes se denominan intrones. Las codificantes exones.

4 . 1 REPLICACION DEL GENOMA PROCARIOTICO

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es es esencialmente el mismo en todas las células. Es un proceso semiconservativo porque cada uno de los dos ADN hijos tiene una cadena del ADN anterior.





En las células procariotas

hay 1 lugar de origen de replicación que se muestra en la horquilla de replicación (replication fork) y que señala el avance de la copia. La horquilla (fork) indica que se está haciendo la separación y la replicación a la vez. El avance es bidireccional, lo que acorta el tiempo. En el sitio en que empieza la replicación se organizan las proteínas en un complejo llamado replisma. La replicación del ADN en procariotas sucede a una velocidad de 500 nucleótidos por segundo.

 
  Genoma: Juego completo de genes compuesto principalmente de DNA. Virus No surgen de virus preexistentes sino que son parásitos intracelulares estrictos, es decir, se desarrollan y reproducen solamente dentro de las células huésped, a las cuales destruyen en este proceso. Sus genomas por tanto son extremadamente reducidos. diversidad Los Virus consisten en un ácido nucleico (ADN o ARN) envueltos en una cubierta de proteína (conocida como cápside). El cápside que contiene el material genetico puede ser una sola proteína que se repite una y otra vez, como en el virus del mosaico del tabaco, o también puede estar formado por varias proteínas, como en los bacteriófagos de la serie T. Esto es debido a un ahorro de secuencia genetica que codifique para grandes polipeptidos teniendo el mismo resultado con la union de muchas copias de uno pequeño.En algunos también se puede encontrar una bicapa lipídica que los rodea cuando se encuentran fuera de la célula —denominada envoltura vírica—. Fuera de la célula huésped, los virus se encuentran como viriones. El genoma de virus de DNA puede ser monohebra (lineal o circular) duplex (lineal o circular), doble hebra con proteínas asociadas covalentemente y puede ser duplexo lineal y con los extremos unidos covalentemente. El genoma de virus de RNA, doble hebra y monohebra y fragmentado (Hay virus de RNA que en vez de tener el genoma en un solo fragmento lo tiene en varias piezas):

El tamaño del genoma varía mucho entre especies. Los genomas víricos más pequeños sólo codifican cuatro proteínas y pesan unos 106 daltons; los más grandes pueden llegar a codificar más de un centenar de proteínas. Los virus ARN suelen tener genomas más pequeños que los virus ADN debido a una tasa de error más alta a la hora de replicarse, y tienen un límite superior de tamaño. Por encima de este límite, los errores en la replicación del genoma hacen que el virus sea 
   
  

Tarea Experimento de Meselson-Stahl

El experimento de Meselson-Stahl fue un experimento realizado en 1957 por Matthew Meselson y Franklin Stahl en el que se demostró que la replicación de ADN era semiconservadora. Una replicación semiconservadora es aquella en que la cadena de dos filamentos en hélice del ADN se replica de forma tal que cada una de las dos cadenas de ADN formadas consisten en un filamento proveniente de la hélice original y un filamento nuevo sintetizado.
El experimento permitió confirmar las teorías de James Watson y de Francis Crick sobre el método de replicación del ADN.

Descripción del experimento Meselson y Stahl
Meselson y Stahl probaron la hipótesis de la replicación del ADN. Ellos cultivaron bacterias en un medio 15N. El 15N es un isótopo pesado de nitrógeno, por lo tanto el ADN sintetizado es de densidad pesada. Ellos entonces cambiaron las bacterias al medio 14N. El ADN se aisló diferentes veces que corresponden a los ciclos de replicación 0, 1, y 2. Después de un ciclo de replicación, el ADN fue todo de densidad intermedia. Esto descarta el modelo conservador de la replicación, que predice que ambos ADN (pesado y liviano) estarán presentes, pero ninguno de densidad intermedia estará presente.

Este resultado es consistente con el modelo semiconservativo de replicación, que predice que todas las moléculas de ADN consistirán de una cadena 15N de ADN y una cadena 14N de ADN.

El resultado no descarta el modelo dispersivo de replicación, que también predice que todo el ADN será de densidad intermedia, consistiendo de segmentos intercalados de doble cadena 15N y 14N.

Después de dos ciclos de replicación, se ven dos bandas de ADN, una de densidad intermedia y una de densidad liviana. Este resultado es exactamente lo que el modelo semiconservativo predice: la mitad debería ser densidad intermedia 15N-14N la intermedia y la mitad de densidad liviana 14N-14N.

Este resultado descarta el modelo dispersivo de la replicación, que predice que después del ciclo 1 de replicación, la densidad del todas las moléculas de ADN, gradualmente llegarían a ser más bajas. Por lo tanto, ningún ADN de densidad intermedia intermedio debería permanecer después del ciclo 2. El modelo semiconservativo es correcto

La centrifugación con CsCl (cloruro de cesio) es un método para separar ADN por densidad.

Para separar al ADN separado con base en densidad, EL ADN se mezcla con CsCl y es centrifugado a muy alta velocidad (p. ej., 50,000 rpm) en una ultracentrifuga por muchas horas. Como los tubos giran, las fuerzas opuestas de sedimentación y difusión producen un gradiente lineal estable de CsCl con la más baja densidad arriba y la densidad más pesada en el fondo. Al formarse el gradiente de CsCl, el ADN se equilibra en el gradiente donde su densidad iguala la densidad del circundante CsCl. Si el ADN de una densidad está presente, el resultado será una sola banda de ADN. Si dos ADN están presentes con densidades diferentes, el resultado será dos bandas de ADN. Haga Click sobre el botón de "Animación" para ver una simulación de la formación de un gradiente de CsCl y la formación de una banda de ADN. Como puede ver en la la animación, note el gradiente de CsCl formado (cambio en el sombreado gris) y la formación de una banda de ADN.
http://www.maph49.galeon.com/adn/cscl1.html

http://es.wikipedia.org/wiki/Experimento_de_Meselson-Stahl

UNIDAD IV REPLICACION DEL ADN

SEP                      SNEST                      DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

Nombre del Alumno:

Eder  Ivan Cuica Campos

Número de Control:

09930035

Carrera:

Lic. biología

Ciudad Altamirano, Gro. México. 06 Marzo del 2012  

Introducción

En este curso de biología molecular se describirá a detalle uno de los  fenómenos  más notables de todos los seres vivos que es; la capacidad de replicación de su material genético a través de  una  enzima denominada DNA-polimerasa que esta  cataliza la formación de cadenas de nucleótidos por la adición sucesiva de nucleótidos.  Este proceso de replicación no comienza a replicar ni al azar ni en cualquier parte. 

La molécula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleótidos que se encuentran dispersos en el núcleo. De esta forma, cada nueva molécula es idéntica a la molécula de ADN inicial.
La replicación empieza en puntos determinados: los orígenes de replicación. Las proteínas iniciadoras reconocen secuencias de nucleótidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteínas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicación. Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias. 

Para investigar la forma de replicación del ADN, Meselson y Stahl idearon una forma muy ingeniosa que se basa en dos premisas fundamentales, por una parte está el hecho de que el nitrógeno es uno de los principales elementos del ADN, y por la otra el nitrógeno posee dos isótopos que pueden ser distinguidos mediante técnicas de laboratorio. ¹⁴N es el isótopo más abundante del nitrógeno, el ADN es también viable con el isótopo ¹⁵N el cual es más pesado y no es radioactivo, solo es más pesado que el nitrógeno común. De esta forma Meselson y Stahl mediante un inteligente planteo del experimento, en el que utilizaron bacterias y observaron cómo replicaban su ADN, pudieron obtener información que les permitió identificar el mecanismo de replicación del ADN y descartar ciertas teorías alternativas

Objetivos.

1._ Entender como se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia

2._ Distinguir los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariotas.

   Metodologia

Para la realización de la unidad 4º se tomaran referencias sobre la bibliografía de:

* M. Devlin Thomas. 2000. Bioquímica, libro de texto con aplicaciones clínicas. Editorial Reverte, S.A.  Impreso en México.

*Puche Acosta F. Javier.  Biología molecular. Antología de la materia Biología celular, 2012.

ORGANISMOS PROCARIONTICOS

.
Los procariontes o procariotas  son células sin núcleo diferenciado (es decir, cuyo ADN está en el citoplasma) y los organismos constituidos por ellas. Las células con núcleo diferenciado rodeado de membrana nuclear se llaman eucariotas; esta distinción entre eucariontes y procariontes se considera la de mayor importancia en el reino animal. Las células procariotas fueron los únicos seres vivos en la Tierra durante 2.000 millones de años hasta la aparición de las eucariotas.
Los organismos procariontes son en su mayoría unicelulares, bacterias, hasta el punto de que ambos términos se han usado a veces como sinónimos. Carl Woese propuso clasificarlos en Bacteria y Archaea (originalmente Eubacteria y Archaebacteria) creyendo que ambos tienen orígenes distintos. Esta controvertida clasificación, finalmente aceptada por la comunidad científica, se denomina «sistema de los tres dominios».
Las células procariontes carecen de citoesqueleto y compartimentos celulares con membrana como vacuolas, retículo endoplásmico, mitocondria y cloroplastos. Tienen un cromosoma pero pueden además presentar pequeñas piezas circulares de ADN denominadas plásmidos. La reproducción es exclusivamente asexual mediante fisión binaria.

3 . 1 . 1  ADN CIRCULAR

El ADN circular puede encontrarse en forma relajada o en forma superenrollada. En la forma relajada, el círculo se halla desplegado sobre un único plano; en la forma superenrollada el contorno del círculo va girando sobre sí mismo de manera tal que adquiere profundidad (véase la figura 8).

Las dos formas de ADN circular pueden visualizarse en el microscopio electrónico como círculos relajados o superenrollados. Además, pueden identificarse por electroforesis o por centrifugación (separación de partículas en suspensión coma ayuda de un campo eléctrico o de un campo gravitacional respectivamente). En estos casos, la estructura compactada del ADN superenrollado aumenta su migración electroforética y su velocidad de sedimentación, lo cual permite diferenciarlo del ADN circular relajado o del ADN lineal.

Como casi todas las propiedades físicas, químicas y biológicas del ADN se vinculan al ADN circular y a su estado relajado o superenrollado, la clara definición de estas formas es importante para alcanzar una acabada comprensión de dichas propiedades. La matemática resulta, en estas circunstancias, un aliado indispensable.

Dado que el ADN es un polímero con propiedades elásticas,cuando se produce la ruptura de una de las dos cadenas complementarias en una molécula superenrollada, la cadena rota gira sobre la sana hasta que se pierde el superenrollamiento. Por tal motivo, cualquier agente físico (radiaciones ionizantes) o químico (bleomicina, radicales libres, etc.) capaz de romper el ADN tiene la capacidad de relajar la molécula circular. Cuando la ruptura del ADN acontece en la célula viva, ocurre habitualmente un proceso enzimático de reparación que cierra la brecha con rapidez y restituye la integridad del ADN circular. En estas condiciones es factible que se recupere también el superenrollamiento. Las modificaciones del enrollamiento del ADN circular se realizan a través de enzimas denominadas topoisomerasas. La topoisomerasa II tiene la propiedad de transformar un ADN circular relajado en superenrollado. Este proceso implica pasar de una forma sin almacenamiento de energía a una forma con alto contenido energético, y por lo tanto es necesaria la presencia de adenosinatrifosfato (ATP) como donante energético.Por el contrario, la transformación de ADN superenrollado en relajado con subsecuente liberación de energía es catalizada directamente por la topoisomerasa I sin necesidad de ATP.

Como se explica detalladamente en "ADN circular y matemática topológica", una modificación estructural en una región limitada de la molécula circular de ADN modifica la topología alolargo de todo el círculo. Estos cambios arquitectónicos son sumamente importantes porque modifican la relación del ADN con proteínas reguladoras y ejercen, por lo tanto,un profundo efecto en el funcionamiento génico.

3 . 1 . 2   PROTEINAS ASOCIADAS

In vivo, el citoesqueleto de actina no está compuesto exclusivamente de actina, sino que para su generación, permanencia y función requiere de otras proteínas; éstas se denominan proteínas de unión a laactina (ABP, actin binding proteins) e intervienen en su polimerización y despolimerización, estabilidad, su organización en haces o redes, su fragmentación y destrucción.^[3] La diversidad de estas proteínas es tal, que se considera que la actina es la proteína que participa en el mayor número de interacciones proteína-proteína de cuantas se conocen.^[46] Por ejemplo, existen elementos que secuestran la actina G, impidiendo su incorporación a los microfilamentos. De igual manera, existen proteínas que estimulan su polimerización o que dotan de complejidad a las redes en síntesis.^[18]

• La timosina β4 es una proteína de 5 kDa capaz de unirse a la actina G-ATP en una estequiometría 1:1; esto quiere decir que una unidad de timosina β4 se une a otra de actina G, en esta proporción. Su papel es impedir la incorporación de los monómeros al polímero en crecimiento.^[47]
• La profilina, una proteína citosólica de 15 kDa que también se une en estequiometría 1:1 a los monómeros de actina G-ATP, pero su función es distinta: facilita el intercambio de nucleótidos ATP por ADP. Además, está implicada en otras funciones celulares, como la unión de repeticiones de Pro en otras proteínas o de lípidos que actúan como segundos mensajeros

Otras proteínas de unión a actina regulan la longitud de los microfilamentos realizando cortes en ellos, lo que da lugar a nuevos extremos activos para la polimerización. Es decir, si un microfilamento, que posee dos extremos a los que pueden unirse o disociarse monómeros, es cortado dos veces, resultan tres nuevos microfilamentos con seis extremos; la nueva situación favorece la dinámica de ensamblaje y desensamblaje. Entre estas proteínas destacan la gelsolina y la cofilina. Cabe resaltar que primero realizan el corte mediante cambios en la conformación del monómero de actina al que se unen en el polímero, quedando después recubriendo el nuevo extremo (+) generado, lo que impide el agregado o el intercambio de nuevas subunidades de actina G y, puesto que los extremos (-) quedan sin recubrir, favorecen la despolimerización de los filamentos.^[51]
Otro tipo de proteínas de unión a actina recubren los extremos de la actina F a fin de estabilizarlos, sin capacidad de romperlos. Ejemplos de estas proteínas son CapZ (que une los extremos (+) según los niveles de Ca²⁺/calmodulina de la célula, niveles que dependen de señales externas e internas de la célula y que intervienen en la regulación de sus funciones biológicas) o la tropomodulina (que une los extremos (-)). La tropomodulina es esencial como estabilizador de la actina F presente en las miofibrillas de los sarcómeros del músculo, estructuras caracterizadas por su gran estabilidad.
El complejo Arp2/3 se encuentra ampliamente difundido en todos los organismos eucariotas. Está compuesto por siete subunidades, algunas de las cuales poseen una topología claramente relacionada con su función biológica: dos de sus subunidades, denominadas «ARP2» y «ARP3», poseen una estructura muy semejante a los propios monómeros de actina. Dicha homología permite a ambas unidades comportarse como agentes nucleantes de la polimerización de los monómeros de actina G a actina F. Además, este complejo es necesario para establecer estructuras dendríticas y en anastomosis (esto es, bifurcadas o en red), por tanto más complejas, de actina F




3 . 1 . 3  ADN EXTRACROMOSOMICO

ADN cromosómico: cromosoma bacteriano

ADN extracromosómico: elemento facultativo (plásmidos,

–

Libres o unidos al cromosoma (episomas)

–

vida bacteriana

Propiedades importantes pero no esenciales para la

–

Replicación independiente del núcleo

–

Transferencia a otras células o herencia a células hijas

–

reguladoras.

Contienen información para su replicación y proteínas

–

posibilidad de perderlos (curación

Se considera como tal una Serie de moléculas facultativas, no esenciales Para la bacteria, que se replican independientemente del cromosoma bacteriano. Se transmiten por herencia a las células hijas, son portadores de genes con una gran función biológica, pero no fundamental, para La vida bacteriana y, por ultimo, Pueden ser Capaces de transmitirse de una bacteria a otra Por con jugacion (sin intermediarios). Como sucede con otros fenómenos de recombinación genética.

3 . 1 . 3 . 1  PLASMIDIOS

Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. El término plásmido fue presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.^[1]
Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.
En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo más común es el de los plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico, de manera que el plásmido únicamente supondrá una ventaja en presencia de ese antibiótico.
Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas.
Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros métodos de selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos nuevos métodos de selección de plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnología, debido a la fuerte crítica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibióticos en los organismos modificados genéticamente.

3 . 1 . 3 . 2   BACTERIOFAGOS

 

3.1.3.3 TRANSPOSONES

Secuencia de DNA que puede moverse de un lugar a otro del cromosoma, insertar copias adicionales de ella misma en otros puntos o pasar de un cromosoma a otro. Tramo de DNA que puede incorporarse en otras moléculas de DNA en lugares donde no hay homología de secuencia. Tienen un tamaño entre 1 y 40 kb. Codifican todas las enzimas necesarias para su inserción. Pueden desplazarse dentro de un cromosoma o entre cromosomas.

3 . 2  ORGANISMOS EUCARIOTICOS

Se denomina eucariotas a todas las células que tienen su material hereditario fundamentalmente (su información genética) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular.Las células eucariotas son las que tienen núcleo definido gracias a una membrana nuclear lo contrario que las procariotas que carecen de dicha membrana nuclear por ello el material genetico se encuentra disperso en estas (a lo largo y ancho de su citoplasma) por lo cual se hace poco perceptible en microscopios electronicos, razón por la cual SE HA DIFUNDIDO LA IDEA ERRONEA DE QUE LAS CELULAS PROCARIOTAS NO CUENTAN CON UN NUCLEO siendo esto erroneo precisamente porque las celulas procariotas si tienen nucleo , lo que no tienen es membrana nuclear por lo tanto no tienen un nucleo definido.Se llaman las célulastontas a aquellas que solo tienen medio núcleo y la mitad de su materia genética esta dispersada por toda ella. A los organismos formados por células eucariotas se les denomina eucariontes.
La alternativa a la organización eucariótica de la célula la ofrece la llamada célula procariota. En estas células el material hereditario se encuentra en una región específica denominada nucleoide, no aislada por membranas en el seno del citoplasma. Las células eucariotas no cuentan con un compartimiento alrededor de la membrana plasmática (periplasma), como el que tienen las células procariotas.
El paso de procariotas a eucariotas significó el gran salto en complejidad de la vida y uno de los más importantes de su evolución.^[1] Sin este paso, sin la complejidad que adquirieron las células eucariotas no habrían sido posibles ulteriores pasos como la aparición de los pluricelulares. La vida, probablemente, se habría limitado a constituirse en un conglomerado de bacterias. De hecho, los cuatro reinos restantes procedemos de ese salto cualitativo. El éxito de estas células eucariotas posibilitó las posteriores radiaciones adaptativas de la vida que han desembocado en la gran variedad de especies que existe en la actualidad.



3 . 2 . 1  ADN LINEAL  Y   EMPAQUETAMIENTO

Cada molécula de ADN se empaqueta en un cromosoma el total de la información genética contenida en los cromosomas de un organismo, constituye su genoma.

Los cromosomas de una célula, en mitosis o fase M, se encuentran muy condensados y son transcripcionalmente activos.

En la interfase, están mucho menos condensados y son activos dirigiendo continuamente la síntesis de RNA.

Cada molécula de ADN que forma un cromosoma ha de contener un centromero, dos telómeros y varios orígenes de replicación.

Para que una molécula de ADN forma un cromisoma funcional ha de ser capaz de dirigir la sintesis de ARN y de propagarse, transmitiendose eficasmente de una generación a otra.

Necesitan un origen de replicación, centrómero que une la molécula de ADN que lo contiene al huso mitótico durante la divición celular telómero eciste uno de ellos encada extremo del cromosoma lineal.

3 . 2 .  1 . 1 HISTONAS

Las histonas son proteínas globulares, de baja masa molecular, muy conservadas evolutivamente entre los eucariotas y en algunos procariotas. Forman la cromatina junto con el ADN, sobre la base de unas unidades conocidas como nucleosomas. La cromatina resuelve el problema de restricción de crecimiento de ADN y nucleo, la cromatina esta formada por DNA y proteinas, la principal proteína formadora son las HISTONAS

Las proteínas celulares más frecuentes son las proteínas histonas, siendo que cada célula eucariótica presenta varios cientos de millones de moléculas de histonas, mientras que las demás proteínas no alcanzan unos cientos (como mucho, a miles). Son proteínas de masa molecular baja, aproximadamente 11-12 Kd y exhiben un alto contenido, cerca de 20%, de lisina y arginina (aminoácidos básicos). Con las cargas positivas de las cadenas laterales de estos restos, las histonas (que son extremadamente básicas) se unen a los grupos fosfato del ADN (cargados negativamente); para ello no es relevante la secuencia de bases dentro del ADN. A menudo, las histonas son modificadas por metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones o ADP-ribosilaciones

–Metilaciones: Determinan cambios permanentes en la cromatina. Están destinadas al mantenimiento de un tipo determinado de expresión génica (Enzimas encargadas: HMTasas)
–Acetilaciones: en las colas de las histonas a nivel de lisina y arginina: modifican la cromatina determinando que pueda transcribir (Enzimas encargadas: HAT)
–Desacetilaciones: determinan la compactación de la cromatina, silencia la actividad transcripcional (Enzimas encargadas: HDAC)

En los seres humanos hay cinco tipos principales: la histona H1 y las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Estas últimas se denominan también histonas nucleosomales y forman un octámero con dos histonas de cada; alrededor de este núcleo se enrolla dos veces un hilo de ADN. Este complejo ADN-histona recibe el nombre de nucleosoma y constituye el componente primario del cromosoma. [2]

El ADN gira unos 147 pares de bases alrededor del núcleo de la histona y a continuación se desplaza unos 20-70 bp en un giro hacia la izquierda hasta alcanzar el siguiente nucleosoma. La pieza intermedia, también denominada ADN de conexión está “desnuda”, es decir, no está equipada con histonas. La histonas H1 se coloca como pieza de cierre en cada nucleosoma y al mismo tiempo toma contacto con las agrupaciones vecinas. De esto modo, las proteínas H1 van “grapando” los nucleosomas para formar un hilo denso: la fibra de cromatina.

Los bacteriófagos (también llamados fagos -son virus que infectan exclusivamente a bacterias.
Al igual que los virus que infectan células eucariotas, los fagos están constituidos por una cubierta proteica o cápside en cuyo interior está contenido su material genético, que puede ser ADN o ARN de simple o doble cadena, circular o lineal (en el 95% de los fagos conocidos es ADN de doble cadena), de 5.000 a 500.000 pares de bases. El tamaño de los fagos oscila entre 20 y 200 nm aproximadamente.
Los fagos son ubicuos y pueden ser encontrados en diversas poblaciones de bacterias, tanto en el suelo como en la flora intestinal de los animales. Uno de los ambientes más poblados por fagos y otros virus es el agua de mar, donde se estima que puede haber en torno a 10⁹ partículas virales por mililitro, pudiendo estar infectadas por fagos el 70% de las bacterias marinas.

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3.2.1.2 SOLENOIDES

Cadena de nucleosomas enrollada helicoidalmente; cada vuelta del solenoide contiene seis nucleosomas (ADN histonas); la estructura se estabiliza con histonas H1.

Los solenoides se enrollan formando la cromatina del núcleo interfásico de la célula eucariota. Cuando la célula entra en división, el ADN se compacta más, formando los

cromosomas.

3 . 2 . 1 . 3 CROMOSOMA

Son segmentos largos de ADN que se encuentran en el centro (núcleo) de las células. El ADN es el material que contiene los genes y es considerado el pilar fundamental del cuerpo humano.

Los cromosomas vienen en pares. Normalmente, cada célula en el cuerpo humano tiene 23 pares de cromosomas (46 cromosomas en total), de los cuales la mitad proviene de la madre y la otra mitad del padre.
Dos de los cromosomas, el X y el Y, determinan si uno nace como niño o como niña (sexo) y se denominan cromosomas sexuales.

• Las mujeres tienen 2 cromosomas X.
• Los hombres tienen un cromosoma X y uno Y.

La madre siempre le aporta un cromosoma X al hijo, mientras que el padre puede contribuir ya sea con un cromosoma X o con un cromosoma Y. Por lo tanto, es el cromosoma del padre el que determina el sexo del niño.
Los cromosomas restantes se denominan cromosomas autosómicos y se conocen como pares de cromosomas del 1 al 22.

3 . 2 . 2  COMPLEGIDAD GENOMICA

Complejidad del genoma humano no radica ya en el número de genes, sino en cómo parte de estos genes se usan para construir diferentes productos en un proceso que es llamado ayuste alternativo (alternative splicing). Otra importante razón de esta complejidad radica en el hecho de que existan miles de modificaciones químicas parafabricar proteínas así como del repertorio de mecanismos que regulan este proceso.

3  . 2 . 3  ADN MITOCONDRIAL

El ADN está presente dentro del núcleo de cada célula de nuestro cuerpo. Pero es el ADN de las mitocondrias de la célula el que ha sido usado más comúnmente para construir árboles evolutivos.

El ADN mitcondrial muestra tazas de mutación altas.

• Las mitocondrias tienen su propio genoma de alrededor de 16,500 bases, el cual existe fuera del núcleo de las células. Cada genoma contiene 13 genes que codifican proteínas, 22 tARN y 2 rARN.
• Grandes cantidades de mitocondrias están presentes en cada célula, lo cual requiere un menor número de muestras.
• Tienen una tasa de substitución (mutaciones donde un nucleótido es reemplazado por otro) más alta que el ADN nuclear, lo cual hace más fácil la resolución de diferencias entre individuos cercanamente emparentados.
• Ellas se heredan solo de la madre, lo cual permite trazar líneas genéticas directas.
• Ellas no se recombinan. El proceso de recombinación en el ADN nuclear (con la excepción del cromosoma Y) mezcla secciones de ADN de la madre y del padre, creando así una historia genética mezclada e ilegible.

3.3 ORGANIZACIÓN GENOMICA VIRAL

• Los virus son parásitos intracelulares obligados.

• Su estructura incluye un ácido nucleico viral (genoma viral) (DNA o RNA pero nunca ambos) ubicado dentro de una cápside proteica.

• Utilizan la maquinaria celular del huésped (transcripcional y traduccional) para su propia replicación.

• El genoma viral codifica toda la información para la replicación viral.

Genoma Viral

- El genoma viral es una molécula de ácido nucleico, DNA o RNA, intacta o segmentada, circular o lineal que funciona como el material genético del virus

Codifica para la síntesis de todos los componentes virales y las enzimas necesarias para la replicación viral. Esta información la almacena en SEIS tipos diferentes de ACIDO NUCLEICO, clasificación basada en la forma en que su ácido nucleico forma el RNAm viral.

   

 

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bacteriófagos atemperados, etc.)