UNIDAD 9 LAS BACTERIAS  DE DIFERENTES ESPECIES  PUEDEN  COMPARTIR PLASMIDIOS

Los genes pueden ser sacados del genoma humano, animal o vegetal y puestos dentro de una bacteria.  Por ejemplo, la hormona insulina humana es producida ahora por bacterias, purificada y vendida en nuestras farmacias para el tratamiento de la diabetes ya que en los pacientes con esta enfermedad sus genes no funcionan normalmente.

El ADN del plasmido usualmente contiene genes para una o mas características que pueden ser beneficiosa para la sobre vivencia de la bacteria.  En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes.  En este ejercicio usted utilizara el plasmidio pGLO que contiene el gene para hacer la GFP.  Usted introducirá el pGLO a la bacteria E coli.   Osea realizará una transformación bacterial.

Si se puede comparti los plasmidios , por que presenta un mecanismo  que les permite a las bacterias a nuevos ambientes natural.

TAREA DE DE LA UNIDAD 8

Todos sabemos que los genes, situados  en el núcleo de todas las células  del organismo , controlan la herencia  de padres y hijos , pero la mayor parte no se da cuenta  de estos 

Cada gen  que mismos  genes  también  controlan la función  cotidiana de todos los organismos, los genes controlan las funciones de las células determinado que sustancias sintetizan dentro de la misma.corresponde a ácidos nucleicos, el ácido desoxirribonucleico (DNA) controla automáticamente la forma de otros ácidos nucleicos, el ácido ribonucleico (RNA)  que después se dispersa por toda la célula para controlar la formación de proteínas específicas.

Los genes y la información genética que tienen las células orientan el desarrollo de organismos. En alguna etapa del desarrollo debe haber diferenciación; la información que tienen las células en la que se divide el cigoto es la misma para todas.
Durante las primeras etapas del desarrollo todas las células son toti potentes; cada una tiene la capacidad de desarrollar un embrión completo. El núcleo conserva todas sus potencialidades y puede diferenciarse en distintos tipos de células.

El operan que regula la actividad de las células bacterianas, no se cree en general que sea el medio de regulación genética de las células de los organismos superiores.
Un Operon es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores

9 . 1 MECANISMO DE TRANSFERENCIA NATURAL

.

 1.      El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena doble.

 2.      Para cada evento de transformación basta la interacción de una sola molécula de ADN con la célula receptora. Por otro lado, el número de moléculas de ADN que puede tomar una misma célula es limitado, y presenta una cinética de saturación (meseta que indica que ya no se pueden captar más moléculas). Observen la cinética de orden 1 en la primera parte de la curva. A partir de cierta concentración de ADN transformante, se da la meseta de saturación (no aumenta el nº de colonias transformadas).

3.      No todas las células de un mismo cultivo son transformables en cualquier momento del ciclo de crecimiento. La competencia es el estado fisiológico característico que permite captar ADN del medio exterior. Este estado de competencia es diferente para cada especie bacteriana capaz de experimentar transformación, y dentro de cada especie está influido por una serie de parámetros como:

9.1. 4 RECOMBINACION

La recombinación es el proceso por el que la información genética se ve redistribuida, tras la transferencia del exogenote al endogenote. La recombinación permite “barajar” grandes conjuntos de genes, suministrando una fuente de variación y selección para la evolución, más rápida que la mutación.

En bacterias encontramos los siguientes tipos principales de recombinación:

1)      Recombinación general u homóloga

2)      Recombinación específica (no-homóloga), en la que a su vez distinguimos:

a)      Rec. específica legítima, conservativa;

 b)      Rec. específica “ilegítima”, propiciada por elementos genéticos transponibles.

Recombinación general u homóloga

	Puede ocurrir en cualquier lugar del genomio, por emparejamiento entre pares de secuencias que presenten una homología suficientemente extensa.
	Depende de la intervención de un equipo enzimático característico, en el que la proteína RecA (o equivalente) es central en el proceso.

Recombinación específica legítima (conservativa)

	Requiere cortas secuencias de homología entre el exogenote y el endogenote (por eso se llama también “específica de sitio”), que son reconocidas por proteínas específicas.
	Es independiente de RecA.
	Este tipo de recombinación es típica de la integración de genomios de fagos en sitios concretos del genomio de bacterias hospedadoras.

Recombinación específica ilegítima: fenómenos de transposición

	No depende de homologías (ni siquiera cortas) entre el exogenote (en este caso, un elemento genético transponible, como IS o Tn) y el endogenote.
	También es independiente de RecA.
	El elemento transponible codifica una enzima (genéricamente se les denomina transposasas) que reconoce secuencias específicas inversamente repetidas en los extremos del propio elemento, lo cual se requiere para el proceso de transposición.
	Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismo replicativo de transposición: es decir, al transponerse dejan una copia de sí mismos en el sitio original, y generan una copia nueva en el sitio a donde se transponen (recombinación específica duplicativa).

9.2 MEACANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL

9.2 MEACANISMOS DE  TRANSFERENCIA ARTIFICIAL

En  contramos los físicos que se utilizan técnicas como la microinyección con una fina aguja de cristal y la electroporación (exposición de las células aun choque eléctrico).

La microinyección:

Es una técnica muy potente y eficaz, ya que 1 de cada 5 células consigue incorporar el DNA foráneo de forma permanente. El problema de esta técnica es que exclusivamente se puede inyectar una célula cada vez, y por tanto no es el más recomendable para una terapia médica debido a que es demasiado laboriosa como para obtener un número de células indicadas  para que el tratamiento tenga éxito.

Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.

La electroporación:

Es una técnica que crea o que dota a la membrana de cierta permeabilidad al DNA durante unos pocos segundos debido a una descarga eléctrica. Si la célula o grupo de células sometidas, a dicho choque eléctrico están sumergidas en un medio rico en plásmidos, alguno de ellos puede penetrar en una célula. El problema que suscita este método es que los choques eléctricos no pueden producir los efectos deseados en algunas células y dañarlas o matarlas debido a esta causa.

  

9.2.2 Químicos

Método del fosfato cálcico. Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc...  

Método del DEAE dextrano. Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes. 

Método DNA desnudo. El DNA desnudo (técnica en fase altamente experiemtal) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.
  Los problemas que encontramos son que el DNA (rico en cargas -) por ser estructura polar  tiene muchas dificultades para cruzar la membrana plasmática. Además el DNA codificante para  1 gen es aproximadamente de 10 kb, esto representa la longitud aproximada de una célula, en el caso de encontrar el DNA sin ningun tipo de compactatción.

Método Péptidos fusiogénicos Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

Método  de Liposomas . los liposomas estan formados por DNA y lipidos no inmunogénicos cargados positivamente (lípidos cationicos).

9.1.5 TRAMSFECCION

9. 1.5 TRANSFECCION

                Se define la transfección como la infección de una célula hospedadora mediante ADN obtenido de un virus. El ADN del virus así introducido, al expresar su programa genético en la célula, termina desencadenando la producción de nuevas partículas de virus dentro, que al igual que en la infección “clásica” por virus completos, conduce a la muerte y lisis de la célula, con la liberación de la progenie de nuevos viriones. Las características de unión de ADN y entrada dependerán del sistema de células competentes que se esté empleando, mientras que el resultado de la transfección depende (al igual que en los ciclos líticos naturales de los virus) del programa del virus en cuestión.

Cuando se agrega ADN a poblaciones de células eucariontes en cultivo, entra a las células y, en algunas de ellas resulta la producción de nuevas proteínas. Este proceso puede hacerse rutinariamente con ADN purificado cuya incorporación lleva a la producción de una proteína particular:

Las células que carecen del gen TK no pueden producir timidina cinasa y mueren en ausencia de timidina:

Agregando ADN TK+

 

Algunas células poseen el gen TK

 

Células carentes del

gen TK (TK-)                                                          colonias de células TK+

       Células muertas         células vivas

9.I.3 TRANSDUCCION

9. 1. 3  TRANSDUCCION

La transducción es la transferencia de información genética desde un donador a un receptor y está mediada por un bacteriófago (fago). La cubierta del fago protege al DNA del medio ambiente, así es que la transducción, a diferencia de la transformación, no se ve afectada por las nucleasas en el medio ambiente. No todos los fagos pueden mediar la transducción. En la mayoría de los casos la transferencia genética se realiza entre miembros de las mismas especies bacterianas. Sin embargo, si un fago en particular posee un amplio rango de huéspedes que él es capaz de infectar, entonces la transferencia entre las especies puede ocurrir. La capacidad del fago para mediar la transducción, está relacionada con el ciclo de vida del mismo.

1. Tipos de Transducción

a. Transducción Generalizada - La transducción generalizada es el  mecanismo por el cual potencialmente cualquier gene bacteriano de la donadora puede ser transferido a la célula receptora. El mecanismo de la transducción generalizada se ilustra en la Figura 3.

Los fagos que median la transducción generalizada, normalmente cortan el DNA de la célula huésped en pequeñas piezas y empacan ambos DNAs al interior de la partícula fágica mediante un mecanismo llamado “head full” o llenado de las cabezas del fago. Ocasionalmente una de las piezas del DNA de la bacteria huésped resulta empacada al azar dentro de una cubierta de fago. Por lo tanto cualquier gene de la bacteria donadora puede ser potencialmente transferido, pero solamente se transferirá tanto DNA como pueda caber en una sola cápside. Cuando la célula receptora se infecta con un fago que contiene DNA de una donadora, el DNA de la donadora puede entrar a la receptora. Ya dentro de la célula receptora puede ocurrir el evento de la recombinación generalizada, en el cual se substituye el DNA de la célula donadora por el de la receptora (Figura 2).
 

b. Transducción especializada – La transducción especializada es la transducción en la cual solo ciertos genes del donador pueden ser transferidos al receptor. Diferentes fagos pueden transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos genes. La transducción especializada está mediada por fagos lisogénicos o fagos temperados y los genes que se llegan a transferir dependerán del lugar donde el profago queda insertado en el cromosoma. El mecanismo de la  transducción especializada se ilustra en la Figura 4.

Durante la escisión (separación) del profago, un error llega a ocurrir ocasionalmente en el cual un poco del DNA del huésped escinde (se separa del cromosoma) junto con el DNA del fago. Solo puede ser transferido el DNA del huésped que esté flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha insertado, (ej. transducción especializada). Después de la replicación y la liberación del fago y a través de la infección de la célula receptora, puede ocurrir una lisogenización de la receptora dando como resultado la transferencia estable de los genes de la donadora. La receptora ahora tendrá dos copias de los genes que le fueron transferidos. También es posible que se lleve a cabo una recombinación legítima entre los genes de la donadora y de la receptora.

2. Importancia – La conversión lisogénica (mediada por fago) ocurre en la naturaleza y es la fuente de donde proceden las cepas virulentas

9.1.2 CONJUGACION

9. 1. 2   CONJUGACION

La conjugación es la transferencia de DNA de una donadora a una receptora, mediante contacto físico directo entre las células. En las bacterias existen dos tipos de células y son las donadoras (macho) y las receptoras (hembras) y la dirección de la transferencia genética es en un solo sentido; así el DNA se transfiere desde la donadora hacia la receptora.

1. Tipos de células acopladas (mating cells) en las bacterias

a. Donadora – La capacidad de una bacteria de ser el donador es consecuencia de la presencia en dicha célula de una pieza extra de DNA, llamada factor F, factor de fertilidad o factor sexual. El factor F es una pieza circular de DNA que es capaz replicar en forma autónoma en la célula; es un replicón independiente. Las piezas de DNA extra-cromosomal que pueden replicar autónomamente, reciben el nombre genérico de plásmidos. El factor F posee los genes necesarios tanto para su replicación como para su habilidad de transferir DNA a la célula receptora. Una de las cosas que el  factor F codifica es la capacidad de producir una estructura llamada pilus sexual (pilus F) sobre la superficie de la bacteria. Este pilus es importante en el proceso de conjugación. El factor F no es el único plásmido que puede mediar la  conjugación pero generalmente se toma como modelo

b. Receptora – La capacidad de actuar como receptora es consecuencia de la carencia de esta célula del factor F.

2. Estados fisiológicos del factor F

a. (F⁺) Autónomo – El factor F en este estado lleva solamente aquellos genes necesarios para su replicación y para la transferencia de DNA. No hay genes cromosomales asociados con el factor F en las cepas F⁺.

En los cruces del tipo F⁺ X F^- el F^- se convierte en F⁺ mientras que F⁺ permanece como F⁺. Por lo tanto, el factor F es infeccioso. Por otra parte, solamente se presenta un bajo nivel de transferencia de los genes cromosomales de la donadora.

b. (Hfr) Integrado - En este estado el factor F se encuentra integrado en el cromosoma bacteriano, vía un evento de recombinación, como se ilustra en la Figura 5ª

En los cruces del tipo Hfr X F^- el F^- raramente se convierte en Hfr y la célula Hfr permanece como tal. En éste caso existe una alta frecuencia de transferencia de los genes cromosomales del donador, de ahí que el nombre de la cepa sea hfr, del inglés high frequency of recombination

c. Autónomo con genes cromosomales (F') - En este estadio el factor F es autónomo, pero ahora contiene algunos genes cromosomales. Los factores F' se producen por escisión del factor F de una Hfr, como se ilustra en la Figura 5b. Ocasionalmente, cuando el factor F se escinde del cromosoma Hfr, los genes del donador localizados en cada lado del factor F pueden escindir junto con el factor F generando una F'. Los factores F' se denominan dependiendo de los genes cromosomales que contienen.

En los cruces del tipo F' X F^- el F^- se convierte a F' mientras que F' permance como tal. Por otra parte esta bacteria presenta una alta frecuencia de transferencia de aquellos genes cromosomales se encuentran en el F' y presenta una baja frecuencia de transferencia de otros genes cromosomales del donador.

. Mecanismo de la conjugación.

a. Cruces F⁺ X F^- (Figura 6)

Transferencia de DNA – El DNA sufre un corte en el sitio de origen de la transferencia y se replica mediante un mecanismo de círculo rodante. En este caso el DNA que se transfiere primero es el del cromosoma. Dependiendo del lugar del cromosoma donde el factor F se ha integrado y en qué orientación lo haga, diferentes genes cromosomales serán transferidos a tiempos diferentes. Sin embargo, el orden relativo y las distancias de los genes siempre permanecerán igual.  Solo hasta que el cromosoma entero se haya transferido, entonces el factor F se transferirá. Ya que los movimientos tales como las fuerzas de agitación son capaces de separar a los pares sexuales formados, es raro que el cromosoma entero se transfiera. Por ello, la receptora generalmente no recibe el factor F en un cruce Hfr X F^-.

iii) Recombinación legítima – La recombinación entre el DNA transferido y el cromosoma da como resultado un intercambio del material genético entre la donadora y la receptora.

iv) Este mechanismo explica las caracteristicas de los cruces Hfr X F^-. La receptora permanece como F-, la donadora permanece Hfr y existe una  alta frecuencia de transferencia de los genes cromosomales a partir de la donadora.
 

c. Cruces F' X F^- (Figura 8)

i) Formación del Par

ii) Transferencia del DNA - Este proceso es similar al cruce F⁺ X F^-. Sin embargo, debido a que el F' lleva algunos genes cromosomales estos también van a ser transferidos.

iii) Recombinación homóloga. No es necesaria aunque puede ocurrir.

iv) Este mecanismo explica las características de los cruces F' X F^-. El F- se convierte en F', el F' permanece como tal y la se presenta una alta frecuencia de transferencia de los genes del donador que van en el F' pero una baja frecuencia de transferencia de otros genes cromosomales del donador.

4) Importancia – Entre las bacterias Gram negativas esta es la forma principal en que se transfieren los genes. La transferencia puede ocurrir entre diferentes especies bacterianas. La transferencia de resistencia múltiple a los antibióticos por conjugación ha llegado a ser un problema relevante en el tratamiento de ciertas enfermedades bacterianas. Debido a que la célula receptora se convierte en donadora después de la transferencia del plásmido, es fácil ver por qué un gen de resistencia a los antibióticos que va en un plásmido puede rápidamente convertir una población sensible de bacterias en una resistente.

Las bacterias Gram positivas también tienen plásmidos que llevan genes de resistencia múltiple a los antibióticos, en algunos casos estos plásmidos se transfieren por conjugación mientras que en otras ellos se transfieren por transducción. El mecanismo de conjugación en las bacterias Gram + es diferente al de las Gram -. En las bacterias Gram + el donador produce un material adhesivo el cual causa agregación con el receptor y el DNA se transfiere.

9.1,1 TRANSFORMACION

La transferencia genética en bacterias es unidireccional y va de una célula donadora a una receptora y la donadora usualmente cede solamente una pequeña parte de su DNA a la receptora. Por tanto, no se forman cigotos completos; en su lugar se forman cigotos parciales (merocigotos).

Los genes bacterianos usualmente se transfieren a miembros de la misma especie aunque ocasionalmente puede ocurrir transferencia hacia otras especies. La Figura 1 ilustra las transferencias genéticas que se ha demostrado que ocurren entre especies bacterianas diferentes

La transformación es la transferencia genética que resulta de la incorporación de DNA desnudo por una célula receptora desde una célula donadora. Ciertas bacterias (ej. Bacillus, Haemophilus, Neisseria, Pneumococcus) son capaces de tomar DNA del medio ambiente y ese DNA que es introducido puede llegar a ser incorporado al cromosoma de la célula bacteriana receptora.

1. Factores que afectan la transformación.

a. Tamaño del DNA – Funciona mejor el DNA de doble cadena de al menos 5 X 10⁵ daltones. Por tanto, la transformación es sensible a las nucleasas del medio ambiente.

b. Competencia de la célula receptora – Algunas bacterias son capaces de incorporar DNA en forma natural. Sin embargo, estas bacterias solo toman al DNA en una etapa particular de su ciclo celular, cuando producen una proteína específica llamada factor de competencia. Cuando la bacteria se encuentra en este estadio se dice que es competente. Otras bacterias no son capaces de incorporar el DNA naturalmente, sin embargo en estas bacterias la competencia puede ser inducida in vitro mediante tratamiento con sustancias químicas (ej. CaCl₂).

2. Pasos de la transformación.

a. Incorporación del DNA – La incorporación del DNA por las bacterias Gram+ y Gram- es diferente. En las bacterias Gram+ el DNA se introduce en forma de moléculas de cadena sencilla y la cadena complementaria se sintetiza dentro de la célula receptora. En contraste, las bacterias Gram- incorporan DNA de doble cadena.

b. Recombinación General/Legítima/Homóloga – Luego de que el DNA de la célula donadora se ha incorporado, ocurre un evento de recombinación recíproca entre el cromosoma y el DNA de la célula donadora. Esta recombinación requiere de que exista homología entre el DNA del donador y el cromosoma receptor, lo que finalmente resulta en la substitución de DNA entre la receptora y la donadora, como se ilustra en la Figura 2.